此前，艾偉拓產(chǎn)品團(tuán)隊(duì)通過多期軟文與視頻，分析了生物制劑中緩沖體系的重要作用及篩選考量，歡迎您前往艾偉拓公眾號(hào)對(duì)之前的幾篇文章進(jìn)行回顧。

本期，艾偉拓產(chǎn)品團(tuán)隊(duì)延續(xù)這一話題，對(duì)抗體等蛋白制劑在純化工藝中的緩沖體系選擇進(jìn)行討論。

抗體等蛋白類生物制劑的聚集，可能會(huì)影響產(chǎn)品的潛在免疫原性，其電荷異質(zhì)性也可能影響treatment的安全性和有效性。

此前，我們主要將目光聚焦于成品制劑的穩(wěn)定性。但值得注意的是，抗體蛋白在加工純化等工藝過程中的穩(wěn)定性也需要給予關(guān)注。為此，艾偉拓產(chǎn)品團(tuán)隊(duì)結(jié)合一篇來自印度理工學(xué)院的研究論文，對(duì)抗體蛋白純化主要工藝步驟中的緩沖體系選擇進(jìn)行討論。

01 蛋白A親和層析

蛋白A親和層析是抗體產(chǎn)品純化工藝中普遍存在的捕獲步驟，Protein A的成功是由于其特別而重要的能力，可以有效地捕獲抗體蛋白產(chǎn)物(回收率為95-99%)，同時(shí)去除絕大多數(shù)宿主細(xì)胞雜質(zhì)(宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)和核酸)。

蛋白A的洗脫通常在低pH下進(jìn)行，隨后在低pH下進(jìn)行病毒失活。然而，低pH與抗體蛋白的聚集有關(guān)，這是由于Fc結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)變化導(dǎo)致洗脫過程中可溶性高分子量聚集體和/或不溶性沉淀物的增加。

使用SEC（分子排阻色譜）分析抗體聚集(圖1A)。可以看出，在4°C和30°C下，即使在無鹽緩沖液中保存長達(dá)7天，抗體蛋白聚集程度的增加也很小。only的例外是檸檬酸緩沖液，即使在沒有鹽的情況下也能觀察到相當(dāng)數(shù)量的聚集。

鹽的加入(離子強(qiáng)度~0.2 ~ 0.3 mol/L)幾乎在所有情況下都能突出提高抗體蛋白聚集程度，在30℃時(shí)效果更明顯。

由此可以得出初步結(jié)論：

① 鹽和高溫的結(jié)合導(dǎo)致抗體蛋白聚集性突出增加；

② 與醋酸鹽和甘氨酸緩沖液相比，檸檬酸緩沖液傾向于導(dǎo)致更高的蛋白聚集，特別是在高溫下。

因此，建議在低溫條件下進(jìn)行蛋白A親和層析并保存層析產(chǎn)物，如果保持在較高的溫度下，則產(chǎn)物保持時(shí)間應(yīng)限制在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)，盡快進(jìn)入下一個(gè)純化處理步驟。

02 陽離子交換層析

對(duì)于抗體類藥物而言，蛋白聚集是較大的不穩(wěn)定性來源。此外，電荷異質(zhì)性也會(huì)導(dǎo)致抗體蛋白的產(chǎn)品異質(zhì)性。

離子交換層析廣泛應(yīng)用于抗體蛋白純化工藝，研究表明該步驟中電荷異質(zhì)性是影響抗體蛋白穩(wěn)定性的主要因素。圖3A為該研究選擇的不同緩沖條件下抗體蛋白電荷異質(zhì)性隨時(shí)間的變化數(shù)據(jù)。

從總體上看，隨著時(shí)間的推移，主峰含量呈下降趨勢，其中磷酸鹽緩沖液(pH 6.5)的下降幅度較大，磷酸鹽緩沖液(pH 7.5)的下降幅度較小。同時(shí)，鹽的加入使主峰含量降低。

對(duì)于醋酸鹽和檸檬酸鹽緩沖液，發(fā)現(xiàn)主峰含量在1周內(nèi)的變化為小于2%。

在pH為6.5時(shí)，磷酸鹽緩沖液中抗體蛋白的主峰含量發(fā)生了明顯變化，從圖3B中可以看出，時(shí)間和pH值對(duì)帶電變異體的形成都起著重要的作用。

從圖3A中也可以看出，在pH為7.5時(shí)，磷酸鹽緩沖液中抗體蛋白的主峰含量變化可以忽略不計(jì)，而在pH為6.5時(shí)，相同的緩沖液發(fā)生了突出變化。在pH值為6.5時(shí)觀察到的一個(gè)有趣現(xiàn)象是，隨著時(shí)間的推移，主峰含量先降低后增加。

03 陰離子交換層析

圖4A顯示了所選擇的不同緩沖條件下(Tris-HCl pH 7.2和Tris-HCl pH 8)主峰含量隨時(shí)間變化的數(shù)據(jù)。可以看出，在pH 7.2時(shí)，變化不突出。

然而，在pH值為8時(shí)，抗體蛋白產(chǎn)物的電荷異質(zhì)性發(fā)生了相當(dāng)大的變化，在較高的溫度下變化更大。鹽的存在對(duì)主峰含量的影響很小。

圖4B展示了統(tǒng)計(jì)建模的結(jié)果?？梢钥闯?，與陽離子交換層析一樣，pH和時(shí)間對(duì)確定主峰含量起關(guān)鍵作用。

與之前一樣，用pH為8的Tris-HCl緩沖液對(duì)數(shù)據(jù)構(gòu)建等高線圖?？梢钥闯觯S著溫度的升高，設(shè)計(jì)空間減小。允許的離子強(qiáng)度隨著保持時(shí)間的增加而降低，直到100 h后超過允許的極限。在30℃時(shí)，離子強(qiáng)度不建議大于0.05，純化中間產(chǎn)品保持時(shí)間不建議超過60h，以避免主峰含量低于限度。

04 討論

低pH導(dǎo)致抗體蛋白聚集。在遠(yuǎn)離pI的低pH條件下，抗體蛋白是高電荷的，導(dǎo)致電荷排斥，這使蛋白構(gòu)象不穩(wěn)定，這種結(jié)構(gòu)擾動(dòng)會(huì)促進(jìn)抗體的展開介導(dǎo)聚集。這是常規(guī)蛋白A層析和病毒滅活過程步驟的條件下抗體蛋白突出聚集的主要原因。

在高pH (pH 8，接近蛋白的pI)的條件下，觀察到抗體蛋白的電荷異質(zhì)性增加。主峰含量的下降是由于酸性變體的增加導(dǎo)致。天冬氨酸殘基的脫酰胺化是導(dǎo)致抗體降解和療效下降的常見原因。這也是電荷異質(zhì)性在離子交換層析步驟中突出影響蛋白穩(wěn)定性的主要原因。

05 小結(jié)

該研究發(fā)現(xiàn)，蛋白聚集是蛋白A親和層析和病毒失活步驟較大允許保持時(shí)間的主要決定因素，而電荷異質(zhì)性的變化決定了陽離子交換和陰離子交換步驟的較大允許保持時(shí)間。這其中，適宜緩沖體系的選擇對(duì)抗體蛋白在純化過程中的穩(wěn)定發(fā)揮著很大的作用。

在常見的蛋白A親和層析條件下，高離子濃度和高溫會(huì)導(dǎo)致抗體蛋白聚集突出增加；緩沖體系選擇方面，與醋酸鹽和甘氨酸緩沖液相比，檸檬酸緩沖液傾向于導(dǎo)致更高的蛋白聚集。而在離子交換層析中，離子強(qiáng)度、溫度及pH值對(duì)抗體蛋白的電荷異質(zhì)性有較大影響。

總而言之，除了制劑中的緩沖體系，還應(yīng)關(guān)注抗體等蛋白制劑在蛋白純化等過程工藝步驟中的緩沖體系選擇，不同的緩沖體系（種類，pH，離子濃度）會(huì)對(duì)抗體蛋白的穩(wěn)定性產(chǎn)生不同程度的影響，直接影響中間產(chǎn)物的較大允許保持時(shí)間，進(jìn)而影響抗體制劑的穩(wěn)定性與treatment效果。

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